PUBLIKACJE Lecznica dla Zwierząt CM-VET

lek. wet. Przemysław Romiszewski, lek. wet. Mariusz Cichecki*, dr hab. Krzysztof Lutnicki**, prof. dr hab. Krzysztof Kostro**

Animal Medical Center, Holicong, Pennsylvania, USA
*Klinika dla zwierząt „CM-VET” w Łodzi
**Katedra Epizootiologii i Klinika Chorób Zakaźnych Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Przyrodniczego w Lublinie
Leczenie chorób stawów u zwierząt towarzyszących
z zastosowaniem przeszczepu mezenchymalnych komórek macierzystych oraz osocza bogatopłytkowego

Tkanka chrzęstna składająca się z chondrocytów jest w stanie wy- trzymać wielkie obciążenia fizyczne. Urazy mechaniczne, nieprawidło- wości postawy i zmiany patologicz- ne struktury powierzchni stawowej powodują zniszczenie szkieletu ma- trycowego chrząstki stawowej, która nie ulega spontanicznemu gojeniu.
W chorobie osteoartretycznej mamy do czynienia z nadmierną generacją me- diatorów zapalnych, co powoduje przy- spieszenie procesów katabolicznych i postępującą destrukcję powierzchni stawowej. Współczesne metody lecze- nia uszkodzonej powierzchni stawowej i tkanek miękkich układu ruchu, takich jak ścięgna, torebki stawowe i więzadła, to przede wszystkim:

– allogeniczne przeszczepy tkanki po- branej od zmarłego dawcy;
– mozaikoplastyka – autologiczne przeszczepy chrząstki podchrzęstnej metodą artroskopową;
– operacyjne artroskopowe usuwanie osteofitów i płukanie stawów;
– kuretowanie i mikrourazy powierzchni stawowej do podchrzęstnej i połącze- nie jej ze szpikiem kostnym;
– autologiczne przeszczepy chondro- cytów namnażanych w laboratorium do miejsc uszkodzenia;
– matrix associated (z użyciem szkieletu/ rusztowania matrycowego), autolo- giczne przeszczepy chondrocytów umieszczanych w szkielecie matrycy (żelu) kolagenowej lub hialuronowej. Wymienione metody mają ograniczo-
ne zastosowanie w traumatologii, są kosz- towne i praktycznie trudno dostępne dla przeciętnego właściciela zwierzęcia.
MARZEC • 3/2013 www.weterynaria.elamed.pl

Metody leczenia chorób stawów z uży- ciem mezenchymalnych komórek ma- cierzystych są opisywane już od 2003 roku. W ostatnich latach wprowadzono do praktyki weterynaryjnej nową metodę terapii, polegającą na izolacji i przeszcze- pie autologicznych komórek macierzy- stych w osoczu bogatopłytkowym (OBP), możliwą do zastosowania w ambulatoryj- nym leczeniu chorób stawów u zwierząt. Komórki macierzyste charakteryzują się potencjalnie nieograniczoną liczbą po- działów i zdolnością do różnicowania się w inne typy komórek. Pod tym wzglę- dem dzieli się je na totipotentne (zdolne do różnicowania się w każdy typ komó- rek, w tym komórki łożyska), pluripotent- ne (mogące różnicować się w każdy typ komórek dorosłego organizmu z wyjąt- kiem komórek łożyska), multipotentne (zdolne do różnicowania się w kilka ty- pów komórek o podobnych właściwo- ściach i pochodzeniu), unipotentne – ina- czej prekursorowe (różnicujące się tylko do jednego typu komórek).
Występują dwa podstawowe rodzaje komórek macierzystych: embrionalne (ESC) i somatyczne (dorosłe) – multipo- tentne lub unipotentne. Embrionalne ko- mórki macierzyste posiadają największą zdolność do samoodnawiania i różnico- wania się w komórki każdej wykształco- nej tkanki, co daje im największy poten- cjał do zastąpienia dowolnej tkanki, która uległa uszkodzeniu. Niestety, komór- ki embrionalne, oprócz niedogodności związanych z problemem etycznym i mo- ralnym, jeżeli chodzi o ich źródło pocho- dzenia i sposób pobierania, niosą za sobą ryzyko praktycznego zastosowania w po- staci trudności sterowania różnicowa- niem do specyficznych tkanek lub narzą- dów (często tworzą potworniaki).

Drugi rodzaj komórek macierzystych to komórki somatyczne posiadające ogra- niczoną zdolność różnicowania w różne tkanki. Są bardziej przydatne w terapii re- generacyjnej – nie tworzą potworniaków, są pobierane z organizmu pacjenta, przez co nie ma ryzyka odrzucenia.
1. ADSCs (adipose stem cells) to komórki
macierzyste tkanki tłuszczowej induko- wane przez 29 dni, tak aby formowały się chondrocyty (znakowanie proteogli- kanów).
2. ADSCs to komórki macierzyste tkanki tłuszczowej indukowane w kierunku osteoblastów (znakowanie extracellular matrix).
3. ADSCs to komórki macierzyste tkanki tłuszczowej indukowane w kierunku adipocytów (znakowanie hematoksy- liną – organiczny związek chemiczny służący do wybarwiania zasadochłon- nych struktur komórkowych). Komórki macierzyste pobrane ze szpi-
ku kostnego czy tkanki tłuszczowej mają potencjał przemiany i różnicowania się w tkankę kostną, chrzęstną, tłuszczową oraz w komórki ścięgien i więzadeł. Pobie- ranie mezenchymalnych (osoczowych) komórek macierzystych jest prostsze i produkuje wielokrotnie większą ilość komórek gotowych bezpośrednio do uży- cia. Wiąże się to między innymi z brakiem potrzeby ich namnażania oraz zmniej- sza inwazyjność tkanki dawcy (pacjen- ta). Namnażanie laboratoryjne komórek macierzystych pobranych ze szpiku kost- nego obniża ich zdolności reprodukcyjne i możliwość różnicowania się w kolejnych generacjach. Komórki pobrane ze szpi- ku kostnego muszą być namnażane la- boratoryjnie czasami nawet 6 tygodni, a kolejne generacje nie mają pełnej zdol- ności samodzielenia, wydzielania natural-

WETERYNARIA W PRAKTYCE WARTO WIEDZIEĆ

nych peptydów, właściwości chemotak- tycznych i utworzenia matrycy służącej za podstawę do odbudowy zniszczonej tkanki. Mezenchymalne komórki macie- rzyste (MKM) wydzielają cytokiny i czyn- niki wzrostu mające właściwości chemo- taktyczne, które mobilizują i aktywują endogenne komórki uszkodzonej tkanki. Komórki MKM mają zdolności hamowa- nia apoptozy i dodatkowo stymulują pro- ces gojenia. Sam zabieg chirurgiczny po- bierania tkanki tłuszczowej jest prostszy od rutynowej operacji, takiej jak np. ova- riohistorectomia (sterylizacja).
Wskazania kliniczne do użycia auto- logicznego przeszczepu MKM wynikają z przyjętego procesu kwalifikacji. Ocena pacjenta obejmuje analizę jego pełnej hi- storii choroby. Obecność nagłej lub prze- wlekłej kulawizny, związanej z uszkodze- niem jednego lub wielu stawów, która nie uległa poprawie po leczeniu zacho- wawczym i pełnym procesie rehabilita- cyjnym, jest wskazaniem do zastosowa- nia terapii.
Proces właściwej kwalifikacji pacjen- ta do zabiegu obejmuje pełne badania krwi i moczu, odpowiednie badania se-

rologiczne, radiologiczne oraz USG. Poprzednio wykonane zabiegi chirur- giczne nie mają wpływu na decyzje o zakwalifikowaniu czy wykluczeniu pacjenta. Przeciwwskazaniem jest każ- da aktywna infekcja (bakteryjna, wiru- sowa czy grzybicza), mocznica (nefropa- tie w wyniku użycia w procesie leczenia gentamycyny) oraz aktywna choroba no- wotworowa.
Użycie eksperymentalne tej techni- ki w innych przypadkach chorobowych niż opisane jest dopuszczalne przy peł- nej zgodzie i powiadomieniu właścicie- la zwierzęcia o braku zatwierdzonych wyników naukowych (brak formalnego zaakceptowania przez FDA jako uzna- nej metody leczenia) innych schorzeń. Takie leczenie eksperymentalne w po- jedynczych przypadkach jest prowadzo- ne w klinikach i ośrodkach naukowych i dotyczy chorób nerek, jelit, martwicy wątroby, dróg oddechowych, młodocia- nej postaci cukrzycy, niedoczynności tarczycy, chorób mięśnia sercowego, za- stawek, naczyń wieńcowych, trudno go- jących się ran i niektórych chorób o pod- łożu alergicznym.

Osocze bogatopłytkowe (OBP)
Leczenie przy użyciu OBP od kilku lat jest uważane jako alternatywne rozwią- zanie, które pozwala na przyspieszenie gojenia się uszkodzeń stawów, ścięgien i mięśni, a także innych układów w spo- sób, który nie naraża na ryzyko wstrzy- kiwania pacjentom rekombinowanych i modyfikowanych białek. Jest nowocze- sną metodą, będącą połączeniem nowo- czesnych technologii oraz naturalnych zdolności organizmu do leczenia same- go siebie.
OBP zawiera najczęściej 6-9-krotną liczbę płytek krwi, które spełniają klu- czową rolę w aktywacji i stymulowaniu transformacji MKM w procesie regene- racyjnym. Oprócz dobrze znanej funk- cji hemostatycznej płytki krwi uwalniają substancje, które sprzyjają naprawie tka- nek, przyspieszają angiogenezę i zapale- nie. Te bezjądrzaste fragmenty komórko- we pochodzące z megakariocytów szpiku w miejscu uszkodzenia płytki uwalniają cały arsenał substancji zapalnych i mioge- nów biorących udział w procesach napra- wy tkanek. Płytki posiadają cały wachlarz presyntetyzowanych cząstek białkowych

MARZEC • 3/2013 www.weterynaria.elamed.pl

WARTO WIEDZIEĆ WETERYNARIA W PRAKTYCE

100

– białek szkieletu komórkowego, białek sygnałowych, błonowych, regulatorów szkieletu komórkowego. Podczas aktywa- cji płytek dochodzi do egzocytozy ziar- nistości z udziałem mechanizmu mole- kularnego identycznego z pozostałymi komórkami wydzielniczymi organizmu. Głównymi magazynami płytek są: alfa ziarnistości (zawierają najwięcej substan- cji), ziarnistości gęste (zbite) i lizosomy. Płytki krwi zawierają szeroką gamę cyto- kin (FGF-2, IGF-1, PDGF, TGF-􏰀, VEGF, EGF), które pobudzają zdolność rozmna- żania różnych komórek. Mogą być one uwolnione przez aktywację trombiną, ko- lagenem, 5-procentowym chlorkiem wap- nia lub mechanicznie – poprzez cyklicz- ny proces zamrażania i rozmnażania. W sumie ponad 60 różnych substancji biologicznie czynnych, które biorą udział w procesach naprawy tkanek, znajduje się w płytkach (7). Wstrzykiwanie skon- centrowanych płytek krwi, które uwalnia- ją czynniki wzrostu, jest stosowane w celu stymulacji odnowy trudno gojących się uszkodzeń tkanek w przypadku zapa- leń ścięgien, leczenia ostrych i przewle- kłych nadwyrężeń mięśni, zwłóknienia mięśni, naderwania ścięgien i zwiotcze- niach torebki stawowej, a także w lecze- niu uszkodzeń wewnątrzstawowych, ta- kich jak zapalenie, zmiany patologiczne chrząstki stawowej, przewlekłe zapale- nia błony maziowej. Rewitalizacja jest możliwa dzięki autologicznej odnowie komórkowej (ACR), która sprowadza się do dobroczynnego działania własnych czynników wzrostu i mezenchymalnych komórek macierzystych, jest jednym z ty- pów proloterapii (5). W połączeniu z en- dotelialnymi komórkami macierzystymi i keratynocytami pobudza tworzenie ma- cierzy, angiogenezę i naskórkowanie w ra- nach. Największą popularność technika ta zdobyła w roku 1998, nie tylko w me- dycynie rekonstrukcyjnej (6), z powodze- niem stosowana jest również w leczeniu koni i psów (1). Użycie autologicznego przeszczepu osocza bogatopłytkowego (PRP), będącego istotą tej techniki zabie- gowej, pozwala na zastosowanie w prak- tyce w miarę bezpiecznego i stosunkowo dobrze tolerowanego przez pacjenta, uni- kalnego „eliksiru młodości”, o ile w ogó- le taki istnieje. Uważa się, że materiał ten wykazuje korzystne działanie w regene- racji kolagenu, leczeniu ran i przy ope- racjach rekonstrukcyjnych z udziałem przeszczepów. Wysoce skoncentrowa-
MARZEC • 3/2013 www.weterynaria.elamed.pl

ne czynniki wzrostu zawarte w PRP to: oddziałujący na keratynocyty naskórko- wy czynnik wzrostu EGF, aktywujące fi- broblasty do produkcji nowego kolage- nu – płytkowy czynnik wzrostu (PDGF) i transformujące czynniki wzrostu (TGF), stymulujące fibroblasty do produkcji ko- lagenu oraz aktywujące różnicowanie się różnych typów komórek, aktywują- ce angiogenezę białko sygnalizacyjne, czynnik wzrostu nabłonka naczyniowe- go (VEGF).
W części środkowej cytoplazmy płytek znajdują się ziarnistości delta (uwalnia- jące serotoninę, ADP i Ca), gamma (wy- dzielające przede wszystkim kwaśne hy- drolazy) oraz alfa. Ziarnistości alfa płytek krwi zawierają białka adhezyjne (między innymi czynnik von Willebranda, lamini- nę-8, trombospondynę-1), czynniki krzep- nięcia, plazminogen, osteonektynę, al- fa-2-antyplazminę, inhibitor aktywatora plazminogenu PAI-I, alfa makroglobu- linę, glikoproteinę bogatą w histydynę, tkankowy inhibitor proteazy-4, metalo- proteazę-4, alfa-1 antytrypsynę, inhibi- tor C1, białka błonowe, siarczan chon- droityny, albuminy, immunoglobuliny, beta tromboglobulinę, czynnik płytkowy 4, proteazową neksynę 2 oraz sieć cyto- kin. Dodatkowo technika ta powoduje stymulację komórek macierzystych me- zenchymalnych przez PDGF, cząsteczki adhezyjne, polipeptydy, witaminy, a tak- że wykazuje działanie ochronne przed nadmiarem wolnych rodników zarówno na drodze enzymatycznej, jak i z udzia- łem nieenzymatycznych zmiataczy.
Praktycznie wszystko sprowadza się do efektów działania w miejscu podania zawartych w PRP ważnych cytokin (dzia- łanie sieci cytokin), odpowiedzialnych w żywym organizmie za chemotaksję, an- giogenezę, immunomodulację, remode- ling, regenerację tkanek, wzrost produkcji kolagenu, rewaskularyzację, zapoczątko- wywanie różnicowania się komórek, mi- neralizację kości, formowanie macierzy zewnątrzkomórkowej, eliminację czyn- ników zakaźnych z ustroju.
Zwolennicy tej techniki polecają ją jako alternatywę dla zabiegów z użyciem kwa- su hialuronowego oraz u pacjentów, u któ- rych mogą wystąpić reakcje alergiczne. Leczenie tkanek miękkich z użyciem PRP znajduje szczególne zastosowanie w chi- rurgii plastycznej i rekonstrukcyjnej twa- rzy. Pozwala na skrócenie czasu opera- cji, wyeliminowanie konieczności użycia

drenów i opatrunków uciskowych, a tak- że uniknięcie ryzyka komplikacji. Wśród przeciwwskazań do stosowania tego typu terapii najczęściej wymienia się okres cią- ży i laktacji, leczenie przeciwzakrzepowe wdrożone u pacjenta, choroby krwi i no- wotwory. Pacjenci dotknięci porfirią i aler- gią skórną, chorobami metabolicznymi i układowymi powinni również być wy- kluczeni z tego typu terapii.
Niestety, ciągle niewiele wiemy na te- mat bezpieczeństwa użycia PRP, stosun- kowo mało prac dotyczy bezpieczeństwa w porównaniu do skuteczności działania. Obecnie dominują dwa paradygmaty uży- cia tych preparatów w zależności od za- wartości leukocytów w produkcie płyt- kowym – użycie żelu płytkowego w celu uzupełnienia populacji leukocytów in situ czy też produktów zubożonych leukocy- tów, które są dodatkowo napromieniowa- ne w celu zminimalizowania biologiczne- go działania pochodzącego od DNA/ RNA w produkcie finalnym (6). Ten ostat- ni preparat polecany jest bardziej przez wielu specjalistów jako dający ogromne wieloczynnikowe możliwości użycia kli- nicznego.
Przygotowanie osocza bogatopłytkowego OBP Przygotowanie osocza bogatopłytkowe- go OBP do użycia w przeszczepie MKM przedstawia się następująco:
1. Od pacjenta pobieramy 15 ml krwi do trzech probówek o pojemności 5 cm3 zawierających cytrynian (ACD, ang. Acid Citrate Dextrose). Jeżeli ilość pobranej krwi jest zbyt mała, można ją uzupełnić do właściwej objętości roztworem soli fizjologicznej.
2. Następnie wirujemy pobrany mate- riał przez 4 min przy 1000 G (2500 obrotów/min). Używając jednej i tej samej pipety, należy zebrać górną warstwę osocza zawierającą płytki krwi do jednej 15 ml probówki (tak, aby pozostawić 5 mm osocza powyżej warstwy czerwonych krwinek). Zebrane osocze dalej wirujemy przez 8 min przy obciążeniu 1000 G (2500 obrotów/min).
Następnie usuwamy górną warstwę osocza (zawierającego mało płytek), pozostawiając 3 ml osocza bogatopłyt- kowego w probówce. Rozprowadzamy osad z płytek krwi z dna probówki w pozostawionym osoczu.

WETERYNARIA W PRAKTYCE WARTO WIEDZIEĆ

3. Dodajemy 0,5 ml CaCl2 (5-10-proc. roztwór, stężenie końcowe 14 mM, ph 7,0) i dokładnie mieszamy.
4. Pozostawiamy do uformowania skrzepu przez 5-20 min w temp. po- kojowej (można pozostawić nawet do 2-3 godz.).
Przed pobraniem OBP do wstrzykiwań należy delikatnie poluzować skrzep i wte- dy dopiero pobrać do strzykawki odpo- wiednią (konieczną) ilość OBP.
Uwagi:

– powstały żel skrzepowy można używać
bezpośrednio na rany;
– osocze można rozcieńczyć roztworem
0,9-procentowego chlorku sodu, jeżeli
jego ilość jest niewystarczająca;
– osocze można zamrozić (w temp. -20oC) i przechowywać do kolejnego
użycia.
Procedura pobierania tkanki tłuszczowej
Procedura pobierania tkanki tłuszczowej i wykonania przeszczepu komórek ma- cierzystych wygląda następująco:
1. Pobieramy krew i przygotowujemy osocze bogatopłytkowe w sposób, jaki opisano powyżej.
2. Od pacjenta w znieczuleniu ogól- nym chirurgicznie pobieramy tkankę tłuszczową (w ilości 40-80 g) do ste- rylnego pojemnika. Miejsce pobrania tkanki tłuszczowej zależy od indywi- dualnych warunków anatomicznych pacjenta i preferencji chirurga. Najczęściej używany jest tłuszcz załopatkowy, pachwinowy i tłuszcz otrzewnowy (lig. falciformis). Nie na- leży używać tłuszczaków, gdyż mają one własne komórki macierzyste.
3. Tkankę tłuszczową mechanicznie rozdrabniamy i kilkakrotnie pod- dajemy przepłukiwaniu w celu usunięcia resztek powięzi, kawał- ków tkanki mięśniowej i krwi. Tak przygotowany materiał następnie poddajemy trawieniu enzymatycz- nemu przy użyciu hialuronidazy i kolagenazy, w temp. 37°C przez 45 min i przy ciągłym delikatnym mieszaniu. Następnie poddajemy go wirowaniu przez 10 min. przy obciążeniu 800 G (2300 obrotów/ min.). Po odessaniu supernatan- tu możliwe jest pobranie osadu komórkowego zawierającego ko- mórki macierzyste MKM. Filtracja osadu następuje przy użyciu filtra

100 μm i ręcznej pompki podciśnie-
niowej.
4. Następnym krokiem jest wirowanie
przefiltrowanego płynu i osadu MKM przez 10 min w 2300 obrotów/min i przy obciążeniu 800 G.
5. Po usunięciu pipetą górnej warstwy płynu konieczne jest rozpuszczenie osadu MKM w 1-3 ml pozostawione- go osocza.
6. Następnie dodajemy 20 ml buforu i ponownie wirujemy przez 10 min. 7. Kolejna filtracja następuje przez filtr 60 μm i konieczne jest ponowne wi- rowanie przez 10 min w warunkach jak powyżej, a następnie pobranie pipetą górnej warstwy płynu tak, by pozostało go około 0,5 ml powyżej
osadu MKM.
8. Dodajemy uprzednio przygotowany
0,5-2 ml OBP i rozpuszczamy w nim
osad MKM.
9. Tak przygotowaną zawiesinę MKM
przenosimy do przygotowanej pro-
bówki i aktywujemy przed użyciem. 10. Aktywacja (fotobiostymulacja) nastę-
puje światłem LED przez 20 min.
Wykonanie przeszczepu komórek MKM do stawów Konieczne jest ponowne znieczulenie ogólne pacjenta i przygotowanie cho- rych stawów do sterylnej iniekcji. Zasa- dy wstrzykiwania komórek macierzystych bezpośrednio do chorych stawów: 0,3- 0,35 ml/staw psa; 0,1-0,15 ml/staw kota; ilość wstrzykniętych MKM nie powinna przekroczyć 70-80 ml/staw.
Wykonujemy równoczesną iniekcję do- żylną 0,1-0,5 ml zawiesiny MKM w roztwo- rze NaCl przy użyciu 200-mikronowego filtra znajdującego się w standardowym zestawie do transfuzji krwi.
Postępowanie po zabiegu
Postępowanie po zabiegu obejmuje:
– uzupełnienie historii choroby;
– ogólne badanie fizyczne przed i po za-
biegu, ponieważ sam zabieg jest inwazyjny i niekiedy mogą wystąpić komplikacje;
– określenie stopnia kulawizny w stosun- ku do określonego przed zabiegiem; – określenie stopnia ruchomości leczo-
nych stawów;
– ocenę stopnia bólu przy wolnej mani-
pulacji;
– ocenę stopnia bólu przy obciążeniu
fizycznym/dynamicznym podczas:

spaceru, biegu, skakania, wstawania, kładzenia się na powierzchni śliskiej, wchodzenia i schodzenia po scho- dach;
– ocenę zdolności przyjmowania wła- ściwej pozycji do oddawania kału i moczu, bólu i sztywności porannej oraz inicjacji zabawy bez zachęty.
Konkluzje
Stosowane w tej procedurze leczniczej osocze bogatopłytkowe OBP jest źró- dłem hemokin i płytkowych czynników wzrostu stymulujących formowanie agre- gatów matrycy kolagenowej, namnażania i zróżnicowania w komórki chondrocy- tów, osteocytów i innych komórek stawo- wych tkanki łącznej.
Poziom zdolności przemiany MKM otrzymanych z tkanki tłuszczowej jest po- dobny do zdolności komórek macierzy- stych otrzymanych ze szpiku kostnego lub tkanki zarodkowej. Tkanka tłuszczo- wa może być pobrana w czasie ruty- nowych zabiegów operacyjnych u mło- dych zwierząt i po wyizolowaniu MKM mogą być zamrożone i przechowywane w banku celem użycia w przyszłości. Jest to szczególnie ważne w przypadku zwie- rząt z predyspozycją do chorób i ura- zów związanych z układem mięśniowo- szkieletowym. 􏰁
Piśmiennictwo
1. De Rossi R., Anciliero de Oliveira Coelho A.C., Silveira de Mell G.: Effects of platelet plasma gel on skin healing in surgical wound in horses. „Acta Chir. Brasil”, 2009, 4: 276-281.
2. Krasna M., Domanović D., Tomśić A.: Platelet gel stimulates proliferation of human dermal fibroblast in vitro. „Acta Dermatoven APA”, 2007, 3: 105-110.
3. Laplante A., Germain L., Auger F.: Mechanisms of wound reepitalization: hints from a tissue- engineered reconstructed skin to long-standing questions. „FASEB J”, 2001, 15: 2377-2389.
4.Pikuła M., Trzonkowski P.: Biologia komórek macierzystych naskórka oraz ich znaczenie w medycynie. „Post Hig Med Dośw.”, 2009, 63: 449-456.
5. Rabago D., Slattengren A., Zgierska A.: Pro- lotherapy in primary care practice. „Prim Care”, 2010, 1: 65-80.
6. Rožman P., Bolta Z.: Use of platelet growth factors in treating wounds and soft-tissue injures. „Acta Dermatoven APA”, 2007, 4: 156-165.
7. Umeno Y., Okuda A., Kimura G.: Proliferative behaviour of fibroblasts in plasma-rich culture medium. „J Cell Science”, 1989, 94: 567-575.
lek. wet. Przemysław Romiszewski Animal Medical Center, Holicong Pennsylvania, USA
MARZEC • 3/2013 www.weterynaria.elamed.pl

PUBLIKACJE Lecznica dla Zwierząt CM-VET

wtorek, 17 listopada 2015

OPERACJA BIAŁEGO LWA

niedziela, 26 maja 2013

czwartek, 23 maja 2013

środa, 8 maja 2013

Leczenie chorób stawów u zwierząt towarzyszących z zastosowaniem przeszczepu mezenchymalnych komórek macierzystych oraz osocza bogatopłytkowego

O mnie

POZOSTAŁE PUBLIKACJE